Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Были исследованы фазовые равновесия и построены фазовые диаграммы для систем «вода–метанол–хлороформ», «вода–метанол–дихлорметан» и «вода-2-бутоксиэтанол-толуол». Все исследованные тройные системы относятся к типу I (с одной парой несмешивающихся компонентов и одной областью расслоения). При этом размер области расслоения на фазовой диаграмме отражает солюбилизирующую способность используемого гидротропа применительно к данному гидрофобному компоненты («маслу»). Были определены составы равновесных фаз с помощью газовой хроматографии и по измерениям плотности. В отличие от ранее изученной системы с трет-бутанолом, во всех изученных системах наклон коннод монотонен. При этом системы «вода–метанол–хлороформ» и «вода–метанол–дихлорметан» лишь немного отличаются по положению критической точки (она смещена в сторону вершины «масла») и, соответственно, по расположению коннод. В системе же «вода-2-бутоксиэтанол-толуол» критическая точка существенно смещена в сторону вершины воды. Это говорит о большей гидрофобности БЭ по сравнению с трет-бутанолом. Для равновесных фаз были определены плотность, вязкость и показатель преломления. Разность плотностей равновесных фаз демонстрирует различное поведение гидротропов. В системах «вода–метанол–хлороформ» и «вода–метанол–дихлорметан» сравнительно быстрое снижение плотности водной фазы по мере добавления в систему гидротропа приводит к небольшому росту разности плотностей. После этого наблюдается плавное снижение плотности водной фазы вплоть до околокритической области и более быстрое снижение плотности масляной фазы. В результате для обеих систем зависимости разности плотностей фаз от мольной доли гидротропа схожи и демонстрируют плавное снижение вплоть до околокритической области. Для систем «вода-2-бутоксиэтанол-толуол» и «вода-трет-бутанол-толуол» наблюдается отличающийся характер зависимостей: если трет-бутанол после плавного снижения вызывает рост разности плотности фаз до локального максимума, то для бутоксиэтанола наблюдается резкое снижение разности плотностей фаз с последующим плавным приближением к критической точке. Для изученных систем были измерены межфазное натяжение (с помощью методов пластины Вильгельми, висящей капли и вращающейся капли) и корреляционная длина (только для околокритических образцов, с помощью динамического рассеяния света). Для всех изученных систем удалось измерить межфазное натяжение вплоть до околокритической области, где оно составляет менее 0,02 мН/м. Одновременное измерение вязкости, плотности, межфазного натяжения и корреляционной длины позволяет проверить точность теоретических предсказаний (основанных на теории критического скейлинга) о связи основных межфазных свойств системы при приближении к критической точке. На основании полученных результатов планируется подготовить статью об экспериментальном обнаружении связи межфазного натяжения и корреляционной длины в околокритических образцах. Проведена аппроксимация границы расслоения в изученных системах. Форма границы расслоения в системе «вода–метанол–хлороформ» близка к симметричной и на первый взгляд хорошо описывается всеми используемыми функциями. Однако, как видно из графика остатков аппроксимации, остатки по уравнениям Хлаваты и Летчера значительно превышают ошибку эксперимента. Остатки по полиномиальной и кусочно-гладкой функциям значительно меньше, и не превышают 0,4 %мольн. Для системы «вода-метанол-ДХМ» граница расслоения имеет существенно асимметричную форму. Достичь удовлетворительной аппроксимации границы расслоения уравнениями Хлаваты и Летчера при этом не удаётся. Однако, полиномиальная и кусочно-гладкая функции позволяют достичь аппроксимации с ошибкой не более 0,2 %мольн. Можно выявить несколько причин, затрудняющих аппроксимацию границ расслоения на фазовых диаграммах. Во-первых, в окрестностях критической точки граница расслоения деформирована вследствие критических флуктуаций концентрации компонентов. Во-вторых, ветвь границы расслоения вдоль водной фазы может быть деформирована вследствие адсорбции гидротропа, которая достигает максимальных значений при его содержании в системе примерно вдвое меньше критического. В-третьих, ветвь границы расслоения вдоль масляной фазы может быть деформирована вследствие аномалий свойств масляной фазы из-за образования в ней сетки водородных связей между молекулами гидротропа и воды. Так, в изученной системе «вода–БЭ–толуол» наблюдается максимальная вязкость масляной фазы при максимальном содержании в ней БЭ, а при дальнейшем приближении к критической точке вязкость снижается. В некоторых тройных системах может наблюдаться дополнительный эффект, принципиально не позволяющий провести аппроксимацию любыми уравнениями, включающими перенормировку координаты X. Так, в системе «вода–БЭ–толуол» при добавлении малых количеств гидротропа наблюдается уменьшение растворимости толуола по сравнению с его растворимостью в воде. Межфазное натяжение аппроксимировали с использованием ранее предложенной кроссоверной изотермы, включающей функции Ψ1 (аппроксимация изотермы межфазного натяжения Лэнгмюра-Шишковского) и Ψ2 (аппроксимация околокритического поведения). Кроссоверная изотерма хорошо описывает экспериментальные данные по межфазному натяжению во всём диапазоне концентраций гидротропа: от ноля до околокритической области. Однако, реконструкция изотерм адсорбции выявляет сложности с аппроксимацией. Представляет интерес развитие подходов по интерпретации зависимостей межфазного натяжения в области разработки изотерм адсорбции, которые затем могут быть интегрированы для реконструкции изотерм межфазного натяжения. Впрочем, полученные результаты достаточны для предсказания свойств равновесных фаз и межфазных явлений для практических целей. Проведено моделирование поведения компонентов в равновесных фазах изученных систем по методу UNIFAC. Для хлороформа наблюдается существенный дисбаланс предсказываемых по методу UNIFAC активностей между равновесными фазами. Наибольший дисбаланс активностей хлороформа наблюдается при мольной доле метанола в водной фазе около 0,2. Аналогичный дисбаланс активностей дихлорметана, достигающий максимальных абсолютных значений при мольной доле метанола в масляной фазе около 0,05. Наблюдаемые положения максимумов дисбаланса активности «масла» в изученных системах качественно совпадают с перегибами на реконструированных изотермах адсорбции. Вполне возможно, что наблюдаемые аномалии соответствуют микроструктурированию водной фазы при солюбилизации «масла» (хлороформа или дихлорметана). Полученные за первый год выполнения проекта результаты вызывают закономерный вопрос: если поведение гидротропов в тройных системах «вода-гидротроп-масло» двояко, то как сказывается на таком поведении изменение природы гидротропа? Если поведение гидротропов универсально, то простое масштабирование с учётом различий в виде фазовых диаграмм и положения критической точки должно нивелировать различия и приводить к вырождению изотерм к одной генеральной зависимости. Однако, отклонение поведения гидротропа при его замене также двояко: смещается не только критическая мольная доля, но и положение относительно неё изотермы, даже в области низких концентраций гидротропа. Проведены работы по экстракции и анализу липидов бактерий, имеющих значение для определения их систематической принадлежности (хемотаксономический аспект современного полифазного подхода к описанию новых таксонов микроорганизмов). На основании полученных результатов опубликована статья: Frolova, A., Merkel, A. Y., Novikov, A. A., Bonch-Osmolovskaya, E. A., & Slobodkin, A. I. (2021). Anaerotalea alkaliphila gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, anaerobic, fermentative bacterium isolated from a terrestrial mud volcano // Extremophiles, 25, 301–309. DOI:10.1007/s00792-021-01229-w Принята к печати статья: А.А. Кучиерская, А.В. Дияковская, А.Р. Сайфутдинова, А.П. Семенов, А.А. Новиков. Аппроксимация границы расслоения в тройных системах «вода-гидротроп-масло» // Химия и технология топлив и масел. Статья будет опубликована в №5 за 2021 год.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Методики экстракции липидов разработаны с учётом соображений, лежащих в основе классической методики экстракции по Блаю–Дайеру: при экстракции промежуточная точка лежит в околокритической области для используемой тройной системы, а конечная точка соответствует разделению фаз, при котором органическая фаза содержит минимальное количество воды. Изменение полярности компонентов тройных систем существенно влияет как на форму границ расслоения, так и на положение критической точки. Кроме того, изменение свойств компонентов влияет на межфазное натяжение в системах. По этой причине возникает вопрос: как будет влиять добавление электролитов к воде на свойства тройных систем (например, на свойства системы ТХМ–метанол–вода)? Было проведено сравнение положения границ расслоения и критических точек для систем ТХМ–метанол––(вода+NaCl) при температуре +4 °С. При этом кроме референтной системы с дистиллированной водой использовали псевдотройные системы, где вместо воды брали гипотонический раствор 0,3 %мас. NaCl, физиологический раствор 0,9 %мас. NaCl, а также модельную морскую воду 3,5 %мас. NaCl. Добавление хлорида натрия практически не влияет на положение границы расслоения и положение критической точки в системе. Это говорит о возможности использования растворов соли для экстракции по разрабатываемым методикам в случаях, когда при экстракции необходимо поддерживать в определённом диапазоне ионную силу водного компонента. Смещение границы расслоения и критической точки становится заметным только при переходе к фазовой диаграмме в мольных процентах. Кроме того, следует учитывать, что при проведении экстракции сразу же после контакта растворителей с липидсодержащим сырьём состав системы изменяется. При этом наибольшим образом меняются состав и, разумеется, свойства органической фазы, в которой концентрируются липиды из объекта. Для оценки влияния липидов на вид фазовой диаграммы было проведено исследование псевдотройных систем (ТХМ+липид)–метанол–вода, где вместо чистого ТХМ использовали растворы липидов: 0,1 %мас. подсолнечное масло в ТХМ, 1,0 %мас. подсолнечное масло в ТХМ, а также 0,1 %мас. трипальмитина в ТХМ. Были определены положение границ расслоения и критических точек. Добавление липидов резко изменяет вид фазовой диаграммы. Добавление подсолнечного масла смещает критическую точку вдоль кривой расслоения в сторону вершины хлороформа, а также увеличивает двухфазную область со стороны вершины воды. Это говорит о крайне низкой растворимости липидов (особенно таких низкополярных, как трипальмитин) в водно-спиртовых фазах, равновесных с хлороформными фазами при завершении экстракции и, следовательно, об эффективном концентрировании липидов в хлороформном слое при использовании системы ТХМ–метанол–вода. Полученные методики были апробированы на модельных липидсодержащих объектах. В качестве модельных липидсодержащих объектов использовались сырые подсолнечные семечки, мясо курицы (охлажденная грудка), филе свинины (охлажденное), филе трески (свежезамороженное), биомасса Escherichia coli. Анализ липидного состава экстрактов образцов рыбы, мяса (свиньи), филе курицы, семян подсолнечника осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектором испарительного светорассеяния. Полярность наиболее гидрофобного компонента существенно влияет на извлечение триглицеридов. В случаях, когда триглицериды составляют значительную часть общих липидов (например, для семян подсолнечника), извлечение общих липидов также возрастает при переходе к системе с наиболее неполярным гидрофобным компонентом (циклогексаном). Напротив, использование системы со сравнительно полярным этилацетатом приводит к сниженному извлечению триглицеридов, но в некоторых случаях позволяет достичь более высокого извлечения полярных липидов (например, для трески и кишечной палочки). Системы с хлоралканами демонстрируют близкие показатели извлечения триглицеридов и общих липидов. При этом использование системы дихлорметан–метанол–вода позволяет проводить экстракцию образцов особенно быстро благодаря низкой температуре кипения ДХМ и, соответственно, быстрому его упариванию под током инертного газа. Было проведено моделирование некоторых из используемых систем методами молекулярной динамики. Системы для моделирования были составлены с помощью пакета Packmol. Затем составленный файл формата pdb преобразовывали с помощью специально составленного скрипта в среде VMD с получением pdb и psf файлов для моделирования. Собственно моделирование проводили с помощью программы NAMD v2.11 с шагом 2 фс в режиме NPAT-ансамбля (при постоянном числе молекул, постоянных давлении, температуре и площади системы в сечении X-Y) при температуре 298 К, давлении 1 бар, начальных размерах системы 2×2×8 нм. При этом температуру контролировали с использованием Ланжевеновской динамики, а постоянное давление поддерживали поршнем Ланжевена, позволяя системе менять объём только в направлении оси Z. Взаимодействия Ван-дер-Ваальса и электростатические взаимодействия рассчитывали с переключением потенциалов в интервале 8–10 ангстрем. Межфазное натяжение рассчитывали по уравнению γ=0,5*Lz*(Pzz−0,5*(Pxx+Pyy)), используя компоненты тензора давления, усреднённого с шагом 0,5 нс. Каждую систему моделировали не менее 10 нс. Моделирование тройной системы ТХМ–метанол–вода позволило получить оценки межфазного натяжения с приемлемым стандартным отклонением (кроме околокритического состава) и неплохим соответствием экспериментальным данным. Моделирование системы ДХМ–метанол–вода привело к похожим результатам: за исключением околокритического состава наблюдается хорошее соответствие модельных и экспериментальных значений. Полученные модельные значения межфазного натяжения и траектории атомов при моделировании могут быть использованы далее для оценки адсорбции компонентов системы на межфазной границе. Для изученной системы ТХМ–метанол–вода были измерены плотности равновесных фаз после расслаивания с добавлением электролитов и липидов. Плотность измеряли с помощью прибора Anton Paar DMA5000. Прецизионные данные по плотности позволяют быстро и удобно определять состав фаз в псевдотройных системах ТХМ–метанол––(вода+NaCl) и (ТХМ+липид)–метанол–вода по измеренным значениям плотности. Плотности фаз незначительно изменяются при добавлении электролитов, однако эти изменения всё же необходимо учитывать при использовании плотностей фаз для определения состава фаз. Проведённые измерения позволяют быстро контролировать режим расслоения системы ТХМ–метанол––(вода+NaCl) при релевантной для биологических исследований температуре +4 °С и различных концентрациях хлорида натрия в водной фазе. Плотности равновесных фаз после расслоения незначительно отличаются от плотностей системы без добавления липидов, но только до составов, где начинается существенное отклонение положения границы расслоения. Полученные данные могут использоваться для контроля расслоения систем при чрезмерно высоком добавлении липидсодержащего сырья при экстракции. В рамках сотрудничества с ИНМИ РАН имени С.Н. Виноградского были проведены исследования состава липидов архей, относящихся к новым таксонам. Определение липидного состава помогает классифицировать микроорганизмы с точки зрения хемотаксономии, что является необходимым при общепринятом полифазном подходе для описания новых таксонов (видов, родов, семейств). Были проведены исследования состава липидов архей Infirmifilum lucidum и их ближайших родственников (архей Thermofilum adornatum и Thermofilum uzonense). Были проведены исследования состава жирных кислот бактерий рода Alkalibacter: типового представителя Alkalibacter saccharofermentans и нового вида Alkalibacter mobilis.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Процессы расслоения в тройных системах изучались в специально изготовленных ячейках с обратным шлифом и термостатирующей рубашкой. Начальный общий состав системы рассчитывали с учётом ранее полученных сведений о положении кривой расслоения в выбранной системе. Состав равновесных фаз оценивали путём соотнесения с ранее измеренной зависимостью плотности от состава системы вдоль кривой расслоения, интерполированной кусочно-непрерывной функцией, используя скрипт в среде Python. Прецизионное измерение плотности водной и органической фаз после установления равновесия в термостатируемой ячейке позволило определить составы равновесных фаз и построить конноды – линии, соединяющие точки на фазовой диаграмме, показывающие эти составы. Наклон коннод показывает характер распределения гидротропа (спирта) между водной и органической фазами. Сравнение экспериментальных и смоделированных коннод показывает, что такое двоякое поведение гидротропа воспроизводится и в модели, построенной методом молекулярной динамики. При этом особенно хорошо воспроизводится состав масляной фазы, а состав водной фазы отклоняется от экспериментального примерно в регионе перехода от адсорбционного к солюбилизирующему поведению гидротропа. Таким образом, проведено экспериментальное исследование расслоения в тройных системах «хлороформ-метанол-вода», «дихлорметан-метанол-вода», «этилацетат-этанол-вода», «циклогексан-этанол-вода» с помощью измерения плотности равновесных фаз и нахождения составов фаз по ранее изученной зависимости плотности от состава вдоль бинодали. Также проведено моделирование указанных тройных систем методом молекулярной динамики, выявлены возможные источники отклонений моделей от эксперимента, предложены подходы к совершенствованию моделирования. Было проведено моделирование используемых систем методами молекулярной динамики. Параметризация исходных молекул была проведена путём квантово-химических расчётов. Полученные параметры использовались для составления записей в файлы топологии и параметров строения молекул. В отличие от работ на втором году выполнения проекта, собственно моделирование проводили с помощью программы NAMD v3.0alpha, что позволило существенно увеличить производительность расчётов за счёт их выполнения на дискретной видеокарте. Моделирование проводили с шагом 2 фс в режиме NPAT-ансамбля (при постоянном числе молекул, постоянных давлении, температуре и площади системы в сечении X-Y) при температурах 298 К и 277 К, давлении 1 бар, начальных размерах системы 6×6×12 нм. Результаты экспериментальных исследований и результаты моделирования методом молекулярной динамики соотносили путём построения графиков зависимости свойств равновесных фаз (плотности, межфазного натяжения, вязкости) от состава в среде Python с использованием пакета Matplotlib. Аппроксимация зависимостей межфазного натяжения проведена с использованием кроссоверной изотермы, сочетающей описание адсорбционного поведения гидротропа (наподобие изотермы адсорбции Лэнгмюра и изотермы межфазного натяжения Шишковского) и солюбилизирующего поведения в околокритической области (исчезновения разницы свойств равновесных фаз, описываемого уравнением с универсальным критическим показателем по теории околокритического скейлинга, т.е., масштабной инвариантности). Были измерены межфазное натяжение, вязкости, плотности и разница плотностей равновесных фаз для систем «хлороформ-метанол-вода», «дихлорметан-метанол-вода», «этилацетат-этанол-вода», «циклогексан-этанол-вода». Построены зависимости этих свойств от содержания гидротропа в масляной фазе, выявлены возможные источники расхождений между экспериментом и моделированием методом молекулярной динамики. Проведены исследования по полноте извлечения общих липидов в присутствии значительных количеств полярных липидов в образце (путём добавок лецитина). При этом в параллельном эксперименте оценивали скорость расслоения систем в присутствии микрочастиц биомассы. Добавление полярных липидов существенно снижает степень извлечения общих липидов в случае использования системы с циклогексаном. На основании полученных результатов сформулирована обобщённая оптимизированная методика экстракции с использованием изученных тройных систем. Проведены исследования расслоения систем в присутствии плазмонных наночастиц золота и серебра. При расслоении тройных систем в окрестности критической точки в присутствии наночастиц было обнаружено, что в системе «толуол – бутоксиэтанол – вода» происходит коагуляция наночастиц на границе «вода–масло». В системе «толуол – трет-бутанол – вода» коагулируют наночастицы золота, но не серебра. Контролируемая коагуляция наночастиц может быть использована для самосборки агрегатов частиц для целей плазмонной фотоники. Были проведены исследования состава жирных кислот и полярных липидов бактерий Fontivita pretiosa B-254T. Исследования состава липидов бактерий позволили описать новый род бактерий Fontivita.